البروتينات

2. البنية الأولية للبروتين

تعريف البنية الأولية

> البنية الأولية (structure primaire) لبروتين أو ببتيد هي تسلسل (séquence) أحماضه الأمينية في السلسلة: عددها وطبيعتها وترتيبها، مقروءاً من النهاية الأمينية N إلى النهاية الكربوكسيلية C. تثبّتها الروابط الببتيدية، وهي روابط تكافؤية قوية، وتُذكر معها عادة مواضع جسور ثنائي الكبريت إن وُجدت.

نكتب البنية الأولية بالرموز الثلاثية للأحماض الأمينية مفصولة بشرطات، ابتداءً من النهاية N على اليسار. فالكتابتان $\text{Gly-Tyr-Lys-Ala}$ و $\text{Ala-Lys-Tyr-Gly}$ تمثّلان رباعيي ببتيد مختلفين رغم أن لهما التركيب نفسه: في الأول الغليسين هو الذي يحمل مجموعة الأمين α الحرة، وفي الثاني الألانين (مجموعة $\ce{-NH2}$ في سلسلة الليزين الجانبية حرة في الحالتين، لكنها لا تحدّد النهاية N).

التسمية

نسمّي الببتيد بأسماء أحماضه الأمينية بالترتيب من N إلى C، ونستبدل اللاحقة «ine» بـ «yl» (في أغلب الأحماض: glycine ← glycyl) في كل الأحماض إلا الأخير الذي يحتفظ باسمه كاملاً:

| الببتيد | الاسم | |---|---| | $\text{Gly-Ala}$ | $\text{glycyl-alanine}$ | | $\text{Gly-Tyr-Lys-Ala}$ | $\text{glycyl-tyrosyl-lysyl-alanine}$ | | $\text{Met-Gly-Ser}$ | $\text{méthionyl-glycyl-sérine}$ |

الصيغة نصف المفصلة

نكتب الهيكل $\ce{-NH-CH(R)-CO\bond{-}}$ مرة لكل حمض أميني ونضع السلاسل الجانبية بين قوسين. صيغة $\text{Gly-Tyr-Lys-Ala}$، سطراً لكل حمض أميني:

$ \begin{array}{l} \ce{H2N-CH2-CO\bond{-}} \\ \ce{-NH-CH(CH2-C6H4-OH)-CO\bond{-}} \\ \ce{-NH-CH((CH2)4-NH2)-CO\bond{-}} \\ \ce{-NH-CH(CH3)-COOH} \end{array} $

السطر الأول بقية الغليسين (النهاية N)، والثاني التيروزين، والثالث الليزين، والأخير الألانين (النهاية C). في الجزيء ثلاث روابط ببتيدية، وكتلته المولية:

$ M = 75 + 181 + 146 + 89 - 3\times18 $

$ M = 491 - 54 = 437\ g\,mol^{-1} $

أهمية التسلسل: مثال فقر الدم المنجلي

البنية الأولية يحدّدها البرنامج الوراثي للخلية، وهي التي تحدّد كيف تلتف السلسلة وتنطوي في الفراغ، فتحدّد وظيفة البروتين. يكفي تغيير حمض أميني واحد لتغيير هذه الوظيفة:

• يتكوّن الهيموغلوبين من أربع سلاسل: سلسلتان α (141 حمضاً أمينياً لكل منهما) وسلسلتان β (146 حمضاً أمينياً لكل منهما).
• في **فقر الدم المنجلي** (drépanocytose) يُستبدل الحمض الأميني السادس من السلسلة β، حمض الغلوتاميك Glu، بالفالين Val.
• يصير الهيموغلوبين أقل ذوباناً حين يفقد الأكسجين، فتتشوّه الكريات الحمراء وتأخذ شكل المنجل.

حساب الأثر على الكتلة: يتغير $M$ للسلسلة β بالفرق بين الحمضين، لأن عدد الروابط لا يتغير:

$ \Delta M = M_\text{Val} - M_\text{Glu} $

$ \Delta M = 117 - 147 = -30\ g\,mol^{-1} $

عدد التسلسلات الممكنة

• ببتيد من $n$ حمضاً أمينياً، يُختار كل منها من الأحماض العشرين: عدد التسلسلات الممكنة $20^n$. لثلاثي الببتيد وحده $20^3 = 8000$ تسلسل، ولبروتين من 100 حمض أميني عدد هائل، ومن هنا تنوّع البروتينات.
• إذا عُرف **التركيب** (أي الأحماض الأمينية)، وكانت $k$ أحماض أمينية مختلفة يظهر كل منها مرة واحدة، فعدد التسلسلات $k!$.
• إذا تكرر حمض أميني نقسم على عدد تبديلات المتكرر: التركيب $\text{Gly, Gly, Ala}$ يعطي $\dfrac{3!}{2!} = 3$ تسلسلات.

مثال محلول 1

ما ثلاثيات الببتيد التي تحتوي الألانين والغليسين والسيرين، كلّ منها مرة واحدة؟

• ثلاثة أحماض مختلفة: عدد التسلسلات $3! = 3\times2\times1 = 6$.
• نكتبها بتثبيت النهاية N في كل مرة:
• $\text{Ala-Gly-Ser}$ و $\text{Ala-Ser-Gly}$
• $\text{Gly-Ala-Ser}$ و $\text{Gly-Ser-Ala}$
• $\text{Ser-Ala-Gly}$ و $\text{Ser-Gly-Ala}$
• النتيجة: **6 ثلاثيات ببتيد مختلفة** لها الكتلة المولية نفسها $75 + 89 + 105 - 36 = 233\ g\,mol^{-1}$، ولذلك لا تكفي الكتلة ولا الإماهة التامة لمعرفة التسلسل.

مستويات البنية الفراغية (للاطلاع)

البنية الأولية هي أساس بنى أعلى منها:

| المستوى | الوصف | الروابط المسؤولة | |---|---|---| | الأولية | تسلسل الأحماض الأمينية | الروابط الببتيدية (تكافؤية) | | الثانوية | التفاف منتظم للسلسلة: حلزون α (hélice α) أو صفيحة β (feuillet β) | روابط هيدروجينية بين $\ce{C=O}$ و $\ce{N-H}$ للهيكل | | الثالثية | انطواء السلسلة كلها في الفراغ | جسور ثنائي الكبريت، روابط أيونية وهيدروجينية بين السلاسل الجانبية | | الرابعية | اجتماع عدة سلاسل (مثل الهيموغلوبين) | روابط ضعيفة بين السلاسل |

التمسخ يهدم البنى الثانوية والثالثية والرابعية، ويُبقي البنية الأولية لأن الروابط الببتيدية لا تنكسر.

جسر ثنائي الكبريت

يتكوّن بين مجموعتي الثيول $\ce{-SH}$ لحمضي سيستئين بالأكسدة، فيربط جزأين من السلسلة نفسها أو سلسلتين مختلفتين:

$ \ce{2 R-SH -> R-S-S-R + 2 H+ + 2 e-} $

مثال: في الأنسولين سلسلتان (A من 21 حمضاً أمينياً و B من 30) يربطهما جسران من ثنائي الكبريت، وفي السلسلة A جسر ثالث داخلي.

تعيين البنية الأولية: المنهجية

لمعرفة تسلسل ببتيد نجمع المعلومات على مراحل:

• **الإماهة الحمضية التامة** ($\ce{HCl}$ تركيزه $6\ mol\,L^{-1}$، نحو $110^\circ C$، نحو 24 ساعة) تعطي **التركيب**: ما الأحماض الأمينية وكم مرة يتكرر كل منها، ونتعرّف عليها بالكروماتوغرافيا. لكنها لا تعطي الترتيب.
• **تعيين النهايتين**: الحمض الأميني ذو $\ce{-NH2}$ الحرة (النهاية N) والحمض ذو $\ce{-COOH}$ الحرة (النهاية C).
• **الإماهة الإنزيمية الجزئية**: إنزيمات تقطع روابط ببتيدية محددة فقط، فتعطي قطعاً قصيرة:

| الإنزيم | الرابطة التي يقطعها | |---|---| | التربسين (trypsine) | الرابطة الببتيدية من جهة الكربوكسيل لـ Lys و Arg | | الكيموتربسين (chymotrypsine) | الرابطة الببتيدية من جهة الكربوكسيل لـ Phe و Tyr و Trp |

• **مطابقة القطع**: نرتّب القطع حتى تتداخل وتعطي تسلسلاً واحداً يوافق كل المعطيات.

> قاعدة: «من جهة الكربوكسيل» تعني أن الحمض المعني يبقى في آخر القطعة الناتجة (نهايتها C). وإذا كان Lys أو Arg هو النهاية C للببتيد كله فلا يجد التربسين رابطة يقطعها بعده.

مثال محلول 2: تعيين تسلسل رباعي ببتيد

رباعي ببتيد (P) أعطت إماهته التامة: Ala و Gly و Lys و Tyr، كلّ منها مرة واحدة. النهاية N فيه هي الغليسين. التربسين يعطي ثلاثي ببتيد وحمض الألانين حراً، والكيموتربسين يعطي ثنائيي ببتيد. جد تسلسل (P) واسمه.

• النهاية N: **Gly** في الموضع 1.
• التربسين يقطع بعد Lys ويحرّر Ala وحده: إذن Ala تلي Lys مباشرة وهي آخر السلسلة، أي **Lys في الموضع 3 و Ala في الموضع 4**.
• يبقى Tyr للموضع 2: $\text{Gly-Tyr-Lys-Ala}$.
• تحقق بالكيموتربسين: يقطع بعد Tyr فيعطي $\text{Gly-Tyr}$ و $\text{Lys-Ala}$، أي ثنائيي ببتيد كما في المعطيات.
• النتيجة: **(P) هو $\text{Gly-Tyr-Lys-Ala}$، واسمه $\text{glycyl-tyrosyl-lysyl-alanine}$**.

> ملاحظة للامتحان: بعد إيجاد التسلسل تحقق منه بكل معطى في النص (كل إنزيم، كل نهاية، كل اختبار)؛ التسلسل الذي يوافق بعض المعطيات فقط مرفوض.

أخطاء شائعة

• قلب جهة القطع: التربسين يقطع **بعد** Lys و Arg (من جهة $\ce{-CO\bond{-}}$) لا قبلهما.
• اعتبار $\text{Gly-Ala}$ و $\text{Ala-Gly}$ مركباً واحداً: النهاية N مختلفة.
• الاكتفاء بالإماهة التامة لمعرفة التسلسل: هي تعطي التركيب فقط.
• قطع الكيموتربسين بعد His أو Lys: يقطع بعد الأحماض العطرية فقط (Phe و Tyr و Trp).

3. النشاط 9: الكشف بتفاعلي بيوري والكزانثوبروتييك

هدف النشاط

نريد أن نعرف، بتجارب بسيطة في أنابيب الاختبار، أمرين عن محلول مجهول:

• هل يحتوي **روابط ببتيدية** كافية، أي ببتيداً من ثلاثة أحماض أمينية فأكثر أو بروتيناً؟ نستعمل **تفاعل بيوري** (réaction du biuret).
• هل يحتوي **حمضاً أمينياً عطرياً** (حراً أو داخل سلسلة)؟ نستعمل **تفاعل الكزانثوبروتييك** (réaction xanthoprotéique).

1. تفاعل بيوري

المبدأ

> في وسط قاعدي قوي، تكوّن شوارد النحاس الثنائي $\ce{Cu^2+}$ مع ذرات الآزوت في الروابط الببتيدية معقداً لونه بنفسجي. يحتاج تكوين المعقد إلى رابطتين ببتيديتين على الأقل، فيكون الاختبار موجباً ابتداءً من ثلاثي الببتيد.

أُخذ الاسم من مركب البيوري (biuret) الذي نحصل عليه بتسخين البولة (urée) فوق درجة انصهارها:

$ \small\ce{2 CO(NH2)2 -> H2N-CO-NH-CO-NH2 + NH3} $

يحمل البيوري مجموعتين $\ce{-CO-NH\bond{-}}$ متجاورتين كما في الببتيد، فيعطي اللون البنفسجي نفسه، ومنه سُمّي الاختبار.

البروتوكول

• نضع في أنبوب اختبار $2\ mL$ من المحلول المدروس.
• نضيف $2\ mL$ من محلول هيدروكسيد الصوديوم $\ce{NaOH}$ لجعل الوسط قاعدياً.
• نضيف قطرة قطرة (3 إلى 5 قطرات) من محلول مخفف لكبريتات النحاس الثنائي $\ce{CuSO4}$، ونرجّ.
• نلاحظ اللون بعد بضع دقائق ونقارنه بـ **أنبوب شاهد** فيه الماء المقطر بدل المحلول، ويبقى لونه أزرق فاتحاً (لون $\ce{Cu^2+}$).

احتياط: زيادة كبريتات النحاس تعطي راسباً أزرق من هيدروكسيد النحاس يحجب اللون البنفسجي، لذلك نضيفها قطرة قطرة:

$ \ce{Cu^2+ + 2 OH- -> Cu(OH)2 v} $

النتائج

| الأنبوب | المحتوى | عدد الروابط الببتيدية | اللون | النتيجة | |---|---|---|---|---| | 1 | ماء مقطر (شاهد) | 0 | أزرق فاتح | سالبة | | 2 | الغليسين | 0 | أزرق فاتح | سالبة | | 3 | $\text{Gly-Ala}$ | 1 | أزرق فاتح | سالبة | | 4 | $\text{Gly-Ala-Ser}$ | 2 | بنفسجي | موجبة | | 5 | محلول بياض البيض | مئات | بنفسجي | موجبة |

> القاعدة: بيوري موجب ⟺ رابطتان ببتيديتان على الأقل ⟺ ثلاثة أحماض أمينية على الأقل. الاختبار لا يدل على حمض أميني معيّن، بل على وجود سلسلة ببتيدية.

كلما زاد عدد الروابط الببتيدية في الحجم المدروس اشتد اللون البنفسجي، وعلى هذا يقوم التقدير اللوني للبروتينات بكاشف Gornall في النشاط 10.

2. تفاعل الكزانثوبروتييك

المبدأ

> حمض الآزوت المركز $\ce{HNO3}$ يُنترج بالتسخين النواة العطرية للأحماض الأمينية التيروزين Tyr والتريبتوفان Trp (والفينيل ألانين Phe بصعوبة أكبر)، فتتكون مشتقات نترو صفراء (xanthos تعني أصفر)، يتحول لونها إلى البرتقالي بعد إضافة قاعدة.

مثال: نترجة التيروزين، حيث $\ce{R}$ تمثّل بقية الجزيء $\ce{-CH2-CH(NH2)-COOH}$:

$ \ce{HO-C6H4-R + 2 HNO3} $

$ \ce{-> HO-C6H2(NO2)2-R + 2 H2O} $

الناتج هو $\text{3,5-dinitrotyrosine}$: دخلت مجموعتا $\ce{-NO2}$ على الحلقة في الموضعين المجاورين لمجموعة $\ce{-OH}$. الموازنة: $\ce{C9H11NO3 + 2 HNO3}$ يعطي $\ce{C9H9N3O7 + 2 H2O}$، أي 9 ذرات C و 13 ذرة H و 3 ذرات N و 9 ذرات O في الطرفين.

البروتوكول

• نضع $2\ mL$ من المحلول المدروس في أنبوب اختبار.
• نضيف بحذر $1\ mL$ من $\ce{HNO3}$ المركز. مع محلول بروتيني يظهر غالباً **راسب أبيض**: البروتين تمسّخ وتخثّر بالحمض.
• نسخّن بلطف في حمام مائي بضع دقائق: يظهر **اللون الأصفر**.
• نبرّد الأنبوب تحت الماء الجاري، ثم نضيف قطرة قطرة محلولاً قاعدياً (هيدروكسيد الصوديوم أو النشادر): يصير اللون **برتقالياً**.

> الأمن: $\ce{HNO3}$ المركز أكّال: قفازات ونظارات، والعمل تحت ساحبة الغازات. إذا لمس الجلد ترك بقعة صفراء، وهي تفاعل الكزانثوبروتييك نفسه مع بروتينات الجلد. ونضيف القاعدة بعد التبريد وببطء لأن التعديل ناشر للحرارة.

النتائج

| المحلول | بعد $\ce{HNO3}$ والتسخين | بعد إضافة القاعدة | النتيجة | |---|---|---|---| | الغليسين | عديم اللون | عديم اللون | سالبة | | التيروزين | أصفر | برتقالي | موجبة | | $\text{Gly-Ala-Ser}$ | عديم اللون | عديم اللون | سالبة | | بياض البيض | راسب أبيض ثم أصفر | برتقالي | موجبة |

> ملاحظة: الفينيل ألانين يعطي لوناً ضعيفاً لأن حلقته بلا مجموعة $\ce{-OH}$ تُنترج بصعوبة. في تمارين البكالوريا نعدّ الاختبار الموجب دليلاً على وجود حمض أميني عطري واحد على الأقل (Phe أو Tyr أو Trp).

3. مقارنة الاختبارين واستغلال النتائج

| الاختبار | الكاشف | ما يكشفه | النتيجة الموجبة | الشرط | |---|---|---|---|---| | بيوري | $\ce{CuSO4}$ في وسط $\ce{NaOH}$ | الروابط الببتيدية | بنفسجي | رابطتان ببتيديتان على الأقل | | الكزانثوبروتييك | $\ce{HNO3}$ مركز + تسخين، ثم قاعدة | النواة العطرية | أصفر ثم برتقالي | حمض أميني عطري واحد على الأقل | | النينهيدرين (تذكير) | النينهيدرين + تسخين | مجموعة الأمين α الحرة | بنفسجي مزرق (أصفر مع Pro) | حمض أميني حر أو نهاية N |

الاختباران مستقلان، فلكل محلول أربع حالات:

| بيوري | الكزانثوبروتييك | الاستنتاج | |---|---|---| | − | − | حمض أميني حر أو ثنائي ببتيد، بلا نواة عطرية | | − | + | حمض أميني عطري حر أو ثنائي ببتيد فيه حمض عطري | | + | − | ببتيد من 3 أحماض فأكثر بلا حمض عطري | | + | + | ببتيد من 3 أحماض فأكثر فيه حمض عطري، أو بروتين |

مثال محلول

أربعة أنابيب $S_1$ و $S_2$ و $S_3$ و $S_4$ تحتوي، دون ترتيب: محلول ألانين، ثنائي الببتيد $\text{Tyr-Gly}$، ثلاثي الببتيد $\text{Lys-Gly-Ser}$، محلول ألبومين بياض البيض. النتائج:

| | $S_1$ | $S_2$ | $S_3$ | $S_4$ | |---|---|---|---|---| | بيوري | − | + | − | + | | الكزانثوبروتييك | + | + | − | − |

• $S_1$: لا رابطتين ببتيديتين، لكن فيه نواة عطرية: هو **$\text{Tyr-Gly}$** (رابطة واحدة فقط، والتيروزين عطري).
• $S_2$: سلسلة طويلة فيها أحماض عطرية: **الألبومين**.
• $S_3$: لا روابط كافية ولا نواة عطرية: **الألانين**.
• $S_4$: رابطتان ببتيديتان بلا نواة عطرية: **$\text{Lys-Gly-Ser}$**.

أخطاء شائعة

• القول إن ثنائي الببتيد يعطي بيوري موجباً لأنه «يحتوي رابطة ببتيدية»: يلزم رابطتان.
• القول إن بيوري موجب يعني «أكثر من ثلاثة أحماض أمينية»: الصواب ثلاثة فأكثر.
• الخلط بين الاختبارين: بيوري للروابط الببتيدية، والكزانثوبروتييك للنواة العطرية.
• ذكر $\ce{CuSO4}$ وحده كاشفاً لبيوري: لا يتكوّن المعقد البنفسجي إلا في وسط قاعدي.

4. النشاط 10: التقدير اللوني لبروتينات بياض البيض

هدف النشاط

نريد أن نعرف كتلة البروتينات في كتلة معلومة من بياض البيض. لا نستطيع وزن البروتينات مباشرة، فنحوّلها إلى لون نقيس شدّته: هذا هو التقدير اللوني (dosage colorimétrique)، ويعتمد على تفاعل بيوري الذي درسناه في النشاط 9.

1. المبدأ

كاشف Gornall

كاشف Gornall هو كاشف بيوري مُثبَّت، يتكوّن من:

| المكوّن | دوره | |---|---| | كبريتات النحاس الثنائي $\ce{CuSO4}$ | مصدر شوارد $\ce{Cu^2+}$ التي تكوّن المعقد البنفسجي مع الروابط الببتيدية | | هيدروكسيد الصوديوم $\ce{NaOH}$ | يجعل الوسط قاعدياً، وهو شرط تكوّن المعقد | | طرطرات الصوديوم والبوتاسيوم المزدوجة | تربط شوارد $\ce{Cu^2+}$ فتُبقيها ذائبة في الوسط القاعدي وتمنع ترسّب هيدروكسيد النحاس | | يوديد البوتاسيوم $\ce{KI}$ | يحمي الكاشف من إرجاع شوارد $\ce{Cu^2+}$ فيحافظ على ثباته |

البروتينات تعطي مع الكاشف معقداً بنفسجياً، وشدّة اللون تتناسب مع كمية البروتين في الأنبوب، لأن عدد الروابط الببتيدية يتناسب مع كتلة البروتين.

طول الموجة

نقيس شدّة اللون بجهاز مقياس الطيف الضوئي (spectrophotomètre) عند طول الموجة $\lambda = 540\ nm$: المحلول البنفسجي يمتص بقوة الضوء الأخضر المصفر حول هذه القيمة، فيكون القياس عندها أكثر حساسية.

2. قانون بير ولامبرت (Beer et Lambert)

يُرسَل ضوء شدّته $I_0$ على حوض فيه المحلول، فيخرج منه ضوء شدّته $I$ أصغر. نعرّف:

> النفاذية (transmittance): $T = \dfrac{I}{I_0}$، وبالنسبة المئوية $T\% = 100\,T$. > > الامتصاصية (absorbance)، وتُسمّى أيضاً الكثافة الضوئية (densité optique): $A = \log\dfrac{I_0}{I}$.

وينص قانون بير ولامبرت، في المحاليل المخففة، على أن:

$ A = \varepsilon\,\ell\,C $

حيث $\varepsilon$ معامل الامتصاص المولي، و $\ell$ سمك الحوض بـ $cm$، و $C$ التركيز. بالحوض نفسه والكاشف نفسه تكون الامتصاصية متناسبة طردياً مع التركيز، فنرسم منحنى المعايرة $A = f(q)$ مستقيماً يمر بالمبدأ.

العلاقة بين $A$ و $T\%$

$ A = \log\dfrac{1}{T} = \log\dfrac{100}{T\%} $

$ A = 2 - \log(T\%) $

مثال: إذا كانت $T\% = 25\ \%$ فإن $A = 2 - \log25 = 2 - 1{,}398 = 0{,}602$. وإذا كانت $T\% = 100\ \%$ (لا امتصاص) فإن $A = 0$.

> انتبه: النفاذية $T$ لا تتناسب مع التركيز؛ نحوّلها دائماً إلى امتصاصية قبل رسم المنحنى.

3. البروتوكول

المحلول القياسي

نحضّر محلولاً قياسياً (solution étalon) من الألبومين تركيزه الكتلي $10\ g\,L^{-1}$ في محلول فيزيولوجي ($\ce{NaCl}$ تركيزه $9\ g\,L^{-1}$). نستعمل المحلول الملحي المخفف لا الماء المقطر لأن بعض بروتينات بياض البيض (الغلوبولينات) لا تذوب في الماء النقي وتذوب في المحاليل الملحية المخففة.

سلسلة المعايرة

التركيز $10\ g\,L^{-1}$ يعني $10\ mg$ في كل $1\ mL$، فكتلة البروتين في الأنبوب $q = 10\ mg\,mL^{-1}\times V$:

| الأنبوب | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |---|---|---|---|---|---|---| | المحلول القياسي ($mL$) | 0 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 | | المحلول الفيزيولوجي ($mL$) | 1,0 | 0,8 | 0,6 | 0,4 | 0,2 | 0 | | كاشف Gornall ($mL$) | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | | $q$ ($mg$) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |

الحجم الكلي واحد في كل الأنابيب ($5\ mL$)، فيتغير مقدار البروتين وحده.

العيّنة

• نزن كتلة $m$ من بياض البيض، ونمدّدها بالمحلول الفيزيولوجي في حوجلة عيارية إلى حجم $V$ (مثلاً $500\ mL$)، ونرجّ جيداً.
• نأخذ $1\ mL$ من هذا المحلول ونضيف إليه $4\ mL$ من كاشف Gornall، تماماً كأنابيب السلسلة.

القياس

• نرجّ الأنابيب ونتركها نحو **30 دقيقة** في درجة حرارة الغرفة بعيداً عن الضوء، حتى يكتمل تكوّن المعقد ويثبت اللون.
• نضبط الجهاز على $\lambda = 540\ nm$، ونجعل امتصاصية **الأنبوب 0** (الشاهد: كاشف ومحلول فيزيولوجي بلا بروتين) مساوية للصفر، فلا نقيس بعدها إلا امتصاص المعقد.
• نقيس امتصاصية الأنابيب من 1 إلى 5 ثم العيّنة.

الاستغلال

$ q_x = \dfrac{A_x}{a} $

$ C = \dfrac{q_x}{V_\text{prélevé}} $

$ m_\text{prot} = C\times V\ ;\ \% = \dfrac{m_\text{prot}}{m}\times100 $

حيث $a$ ميل المستقيم $A = a\,q$. تذكّر أن $1\ mg\,mL^{-1} = 1\ g\,L^{-1}$.

4. مثال محلول 1

السلسلة السابقة أعطت الامتصاصيات: 0 ؛ 0,08 ؛ 0,16 ؛ 0,24 ؛ 0,32 ؛ 0,40. حُضّرت العيّنة بتمديد $m = 25{,}0\ g$ من بياض البيض إلى $500\ mL$، وأعطى $1\ mL$ منها مع $4\ mL$ من الكاشف $A_x = 0{,}22$.

• **المنحنى**: $\dfrac{0{,}08}{2} = \dfrac{0{,}16}{4} = \dots = \dfrac{0{,}40}{10} = 0{,}04$، فالنقاط على مستقيم يمر بالمبدأ معادلته $A = 0{,}04\,q$ ($q$ بـ $mg$).
• **كتلة البروتين في الأنبوب**: $q_x = \dfrac{0{,}22}{0{,}04} = 5{,}5\ mg$، وهي داخل مجال السلسلة (0 إلى 10 mg).
• **التركيز**: $5{,}5\ mg$ في $1\ mL$، أي $C = 5{,}5\ g\,L^{-1}$.
• **الكتلة الكلية**: $m_\text{prot} = 5{,}5\times0{,}500 = 2{,}75\ g$.
• **النسبة**: $\dfrac{2{,}75}{25{,}0}\times100 = 11{,}0\ \%$.

النتيجة: بياض البيض يحتوي نحو $11\ \%$ من كتلته بروتينات، وأغلب الباقي ماء.

5. مثال محلول 2: من النفاذية

بالسلسلة نفسها ($A = 0{,}04\,q$)، مدّدنا $12{,}5\ g$ من بياض بيض آخر إلى $250\ mL$، فقرأ الجهاز للعيّنة نفاذية $T\% = 60{,}26\ \%$.

• $A_x = 2 - \log60{,}26 = 2 - 1{,}780 = 0{,}220$.
• $q_x = \dfrac{0{,}220}{0{,}04} = 5{,}5\ mg$، فـ $C = 5{,}5\ g\,L^{-1}$.
• $m_\text{prot} = 5{,}5\times0{,}250 = 1{,}375\ g$.
• النسبة: $\dfrac{1{,}375}{12{,}5}\times100 = 11{,}0\ \%$. النتيجة: **$11{,}0\ \%$**.

> ملاحظة للامتحان: إذا كانت امتصاصية العيّنة أكبر من امتصاصية آخر أنبوب في السلسلة فهي خارج مجال المنحنى: نمدّد العيّنة من جديد، ثم نضرب النتيجة في معامل التمديد.

أخطاء شائعة

• رسم $T$ بدلالة $q$ كأنها مستقيم: نحوّل أولاً إلى $A = 2 - \log(T\%)$.
• نسيان حجم التمديد: $q_x$ هي كتلة البروتين في $1\ mL$ فقط، لا في كل المحلول.
• الخلط بين $q$ (كتلة بـ $mg$ في الأنبوب) و $C$ (تركيز بـ $g\,L^{-1}$).
• إهمال الأنبوب الشاهد: امتصاص الكاشف الأزرق نفسه يُضاف خطأً إلى امتصاص المعقد.
• معاملة العيّنة بحجوم تختلف عن حجوم أنابيب السلسلة.

5. تمارين محلولة بنمط البكالوريا

التمرين الأول: تسلسل قطعة من بروتين

المعطيات: (P) خماسي ببتيد معزول من إماهة جزئية لبروتين.

• الإماهة الحمضية التامة لـ (P) تعطي: Ala و Gly و Lys و Ser و Tyr، كلّ منها مرة واحدة.
• النهاية N لـ (P) هي الألانين.
• تأثير التربسين على (P) يعطي رباعي ببتيد والسيرين حراً.
• تأثير الكيموتربسين على (P) يعطي ثنائي ببتيد $(D_1)$ وثلاثي ببتيد $(D_2)$؛ و $(D_1)$ يعطي اختبار الكزانثوبروتييك موجباً.
• الكتل المولية بـ $g\,mol^{-1}$: Ala 89، Gly 75، Lys 146، Ser 105، Tyr 181 ؛ $\ce{H2O}$ 18.

الأسئلة:

• ما نتيجة اختبار بيوري على (P)؟ علّل.
• جد تسلسل (P) مع التعليل، ثم سمّه.
• اكتب الصيغة نصف المفصلة لـ $(D_2)$.
• ما نتيجتا اختباري بيوري والكزانثوبروتييك لكل من $(D_1)$ و $(D_2)$؟
• احسب الكتلة المولية لـ (P).

الحل:

• (P) خماسي ببتيد فيه $5 - 1 = 4$ روابط ببتيدية، أي أكثر من رابطتين: **بيوري موجب (لون بنفسجي)**.
• تعيين التسلسل:
• النهاية N: Ala في الموضع 1.
• التربسين يقطع بعد Lys ويحرّر Ser وحده: Ser هي النهاية C (الموضع 5) و Lys قبلها مباشرة (الموضع 4).
• الكيموتربسين يقطع مرة واحدة، بعد Tyr (الحمض العطري الوحيد): القطعة الأولى تنتهي بـ Tyr، والثانية لا حمض عطرياً فيها. $(D_1)$ يعطي الكزانثوبروتييك موجباً، فهو القطعة الأولى، وهو ثنائي ببتيد يبدأ بالنهاية N: $(D_1) = \text{Ala-Tyr}$، أي Tyr في الموضع 2.
• يبقى Gly للموضع 3.
• **(P) = $\text{Ala-Tyr-Gly-Lys-Ser}$**، واسمه $\text{alanyl-tyrosyl-glycyl-lysyl-sérine}$.
• تحقق: التربسين يعطي $\text{Ala-Tyr-Gly-Lys}$ و Ser، والكيموتربسين يعطي $\text{Ala-Tyr}$ و $\text{Gly-Lys-Ser}$.
• $(D_2) = \text{Gly-Lys-Ser}$:

$ \begin{array}{l} \ce{H2N-CH2-CO\bond{-}} \\ \ce{-NH-CH((CH2)4-NH2)-CO\bond{-}} \\ \ce{-NH-CH(CH2OH)-COOH} \end{array} $

• النتائج:

| القطعة | الروابط الببتيدية | بيوري | الكزانثوبروتييك | |---|---|---|---| | $(D_1) = \text{Ala-Tyr}$ | 1 | سالب | موجب (Tyr) | | $(D_2) = \text{Gly-Lys-Ser}$ | 2 | موجب | سالب |

• الكتلة المولية:

$ \sum M_\text{AA} = 89 + 181 + 75 + 146 + 105 $

$ M = 596 - 4\times18 = 524\ g\,mol^{-1} $

النتيجة: $M_{(P)} = 524\ g\,mol^{-1}$.

التمرين الثاني: التقدير اللوني لبروتينات بياض البيض

المعطيات: حُضّرت سلسلة معايرة من محلول قياسي للألبومين تركيزه $5\ g\,L^{-1}$ في محلول فيزيولوجي ($\ce{NaCl}$ تركيزه $9\ g\,L^{-1}$). في كل أنبوب $1\ mL$ (محلول قياسي + محلول فيزيولوجي) و $4\ mL$ من كاشف Gornall، ثم 30 دقيقة بعيداً عن الضوء، والقياس عند $540\ nm$ بعد ضبط الجهاز بالأنبوب 0:

| الأنبوب | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |---|---|---|---|---|---|---| | المحلول القياسي ($mL$) | 0 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 | | $T\%$ | 100 | 75,86 | 57,54 | 43,65 | 33,11 | 25,12 |

العيّنة: $25{,}0\ g$ من بياض البيض مُدّدت بالمحلول الفيزيولوجي إلى $1{,}00\ L$، وعولج $1\ mL$ منها كأنابيب السلسلة فأعطى $T\% = 50{,}12\ \%$.

الأسئلة:

• اذكر مكوّنات كاشف Gornall، ولماذا نمدّد بالمحلول الفيزيولوجي؟
• أثبت أن $A = 2 - \log(T\%)$.
• احسب $q$ و $A$ لكل أنبوب، واكتب معادلة منحنى المعايرة $A = f(q)$.
• احسب نسبة البروتينات في بياض البيض.
• لماذا لا نستعمل تفاعل الكزانثوبروتييك لتقدير البروتينات الكلية؟

الحل:

• كاشف Gornall: $\ce{CuSO4}$ (شوارد $\ce{Cu^2+}$)، $\ce{NaOH}$ (وسط قاعدي)، طرطرات الصوديوم والبوتاسيوم المزدوجة (تُبقي $\ce{Cu^2+}$ ذائبة)، $\ce{KI}$ (يحمي من الإرجاع). نمدّد بالمحلول الفيزيولوجي لأن بعض بروتينات بياض البيض (الغلوبولينات) لا تذوب إلا في المحاليل الملحية المخففة.
• $A = \log\dfrac{I_0}{I}$ و $\dfrac{I}{I_0} = \dfrac{T\%}{100}$، فـ $A = \log\dfrac{100}{T\%} = 2 - \log(T\%)$.
• $5\ g\,L^{-1} = 5\ mg\,mL^{-1}$، فـ $q = 5\,V$:

| الأنبوب | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |---|---|---|---|---|---|---| | $q$ ($mg$) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | | $A$ | 0 | 0,120 | 0,240 | 0,360 | 0,480 | 0,600 |

مثلاً للأنبوب 1: $A = 2 - \log75{,}86 = 2 - 1{,}880 = 0{,}120$. النسبة $\dfrac{A}{q} = 0{,}12$ ثابتة: المنحنى مستقيم يمر بالمبدأ، معادلته $A = 0{,}12\,q$ ($q$ بـ $mg$).

• العيّنة: $A_x = 2 - \log50{,}12 = 2 - 1{,}700 = 0{,}300$.
• $q_x = \dfrac{0{,}300}{0{,}12} = 2{,}5\ mg$ في $1\ mL$، أي $C = 2{,}5\ g\,L^{-1}$.
• في $1{,}00\ L$: $m_\text{prot} = 2{,}5\ g$.
• النسبة: $\dfrac{2{,}5}{25{,}0}\times100 = 10{,}0\ \%$.
• النتيجة: **بياض البيض يحتوي $10{,}0\ \%$ من كتلته بروتينات**.
• تفاعل الكزانثوبروتييك يكشف الأحماض الأمينية العطرية وحدها، ونسبتها تختلف من بروتين إلى آخر، فلا تتناسب شدّة لونه مع كتلة البروتينات الكلية. أما تفاعل بيوري فيكشف الروابط الببتيدية، وعددها يتناسب مع كتلة البروتين.

التمرين الثالث: بروتين بسيط، إماهته وقطعه بالتربسين

المعطيات: (Pr) بروتين بسيط سلسلته واحدة، كتلته المولية $13\,218\ g\,mol^{-1}$. متوسط كتلة البقية $110\ g\,mol^{-1}$، و $M_{\ce{H2O}} = 18\ g\,mol^{-1}$. يحتوي (Pr) ثمانية أحماض Lys وثلاثة أحماض Arg، وليس أيّ منها في النهاية C.

الأسئلة:

• قدّر عدد الأحماض الأمينية في (Pr) وعدد روابطه الببتيدية.
• نُميه إماهة حمضية تامة $2{,}6436\ g$ من (Pr). احسب كتلة الماء المستهلك وكتلة الأحماض الأمينية الناتجة.
• ما نتيجة اختبار بيوري قبل الإماهة وبعدها؟
• كم قطعة (ببتيداً أو حمضاً أمينياً حراً) يعطي تأثير التربسين على (Pr)؟
• سُخّن محلول (Pr) فتخثّر. هل تغيّرت بنيته الأولية؟

الحل:

• $M = 110\,n + 18$، ومنه $n = \dfrac{13\,218 - 18}{110} = \dfrac{13\,200}{110} = 120$ حمضاً أمينياً، وعدد الروابط **$120 - 1 = 119$**.
• الإماهة:
• $n_{(Pr)} = \dfrac{2{,}6436}{13\,218} = 2{,}0\times10^{-4}\ mol$.
• $n_{\ce{H2O}} = 119\times2{,}0\times10^{-4} = 2{,}38\times10^{-2}\ mol$.
• $m_{\ce{H2O}} = 2{,}38\times10^{-2}\times18 = 0{,}428\ g$.
• $m_\text{AA} = 2{,}644 + 0{,}428 = 3{,}072\ g$.
• النتيجة: **الماء المستهلك $0{,}428\ g$، والأحماض الأمينية $3{,}07\ g$**.
• قبل الإماهة: 119 رابطة ببتيدية، **بيوري موجب (بنفسجي)**. بعد الإماهة التامة: أحماض أمينية حرة بلا روابط ببتيدية، **بيوري سالب (أزرق)**.
• التربسين يقطع بعد كل Lys وكل Arg: $8 + 3 = 11$ قطعاً، ولا شيء منها في النهاية C، فكل قطع يضيف قطعة: **$11 + 1 = 12$ قطعة**.
• التسخين يمسّخ البروتين: تنهدم بنيته الفراغية ويتخثّر، لكن روابطه الببتيدية التكافؤية لا تنكسر، **فالبنية الأولية لم تتغير**.

> ملاحظة للامتحان: في تمارين التسلسل اكتب لكل معطى ما يستنتج منه (موضع حمض أو نهاية)، ثم تحقق في الأخير من التسلسل بكل المعطيات؛ وفي التقدير اللوني اكتب كل مرحلة بوحدتها: $A$ ثم $q$ بـ $mg$ ثم $C$ بـ $g\,L^{-1}$ ثم الكتلة ثم النسبة.