الببتيدات

2. التسمية والكتابة وعدد التسلسلات الممكنة

اصطلاح الكتابة بالرموز

نكتب الببتيد بتتابع الرموز الثلاثية لأحماضه الأمينية، يفصل بينها خط قصير، من الطرف N على اليسار إلى الطرف C على اليمين. في ثلاثي الببتيد $\text{Gly-Ala-Ser}$:

• الغليسين هو الطرف N: مجموعة $\ce{-NH2}$ فيه حرة.
• الألانين في الوسط: مجموعتاه α كلتاهما داخلتان في رابطتين ببتيديتين.
• السيرين هو الطرف C: مجموعة $\ce{-COOH}$ فيه حرة.

الترتيب جزء من هوية الببتيد: $\text{Gly-Ala-Ser}$ و $\text{Ser-Ala-Gly}$ ببتيدان مختلفان، لأن الطرف N في الأول غليسين وفي الثاني سيرين.

تسمية الببتيد

> قاعدة التسمية: نقرأ الببتيد من الطرف N إلى الطرف C، ونسمّي كل بقية ما عدا الأخيرة بإبدال نهاية اسمها «ine» باللاحقة «yl» (بالعربية: «ين» تصبح «يل»)، ويحتفظ الحمض الأميني الطرف C باسمه كاملاً.

| الحمض الأميني | اسم البقية بالفرنسية | اسم البقية بالعربية | |---|---|---| | Gly | glycyl | غليسيل | | Ala | alanyl | ألانيل | | Val | valyl | فاليل | | Leu | leucyl | ليوسيل | | Ile | isoleucyl | إيزوليوسيل | | Ser | séryl | سيريل | | Thr | thréonyl | ثريونيل | | Cys | cystéinyl | سيستئينيل | | Met | méthionyl | ميثيونيل | | Asp | aspartyl | أسبارتيل | | Glu | glutamyl | غلوتاميل | | Asn | asparaginyl | أسباراجينيل | | Gln | glutaminyl | غلوتامينيل | | Lys | lysyl | ليزيل | | Arg | arginyl | أرجينيل | | His | histidyl | هيستيديل | | Phe | phénylalanyl | فينيل ألانيل | | Tyr | tyrosyl | تيروزيل | | Trp | tryptophyl | تريبتوفيل | | Pro | prolyl | بروليل |

أمثلة:

• $\text{Gly-Ala-Ser}$: **غليسيل ألانيل سيرين** ($\text{glycyl-alanyl-sérine}$).
• $\text{Lys-Gly-Phe}$: **ليزيل غليسيل فينيل ألانين** ($\text{lysyl-glycyl-phénylalanine}$).
• $\text{Ala-Lys-Asp}$: **ألانيل ليزيل حمض الأسبارتيك**؛ إذا كان الطرف C حمض الأسبارتيك أو حمض الغلوتاميك احتفظ باسمه كاملاً «حمض الأسبارتيك» أو «حمض الغلوتاميك».

كتابة الصيغة نصف المفصلة

الطريقة

• اكتب الهيكل: $\ce{H2N-CH-CO\bond{-}}$ للبقية الأولى، ثم $\ce{-NH-CH-CO\bond{-}}$ لكل بقية وسطى، ثم $\ce{-NH-CH-COOH}$ للبقية الأخيرة.
• ألحق بكل كربون α سلسلته الجانبية بين قوسين، بترتيب الرموز.
• تحقق: عدد المجموعات $\ce{-CO-NH\bond{-}}$ يساوي $n - 1$، ولا يبقى إلا $\ce{-NH2}$ α واحدة و $\ce{-COOH}$ α واحدة.

على شاشة الهاتف نكتب كل بقية في سطر؛ الخط القصير في أول السطر يمثّل الرابطة مع نهاية السطر السابق.

مثال محلول 1: من التسلسل إلى الصيغة

اكتب الصيغة نصف المفصلة لثلاثي الببتيد $\text{Ala-Ser-Lys}$ وسمّه، ثم احسب كتلته المولية. ($M$ بـ g/mol: Ala = 89، Ser = 105، Lys = 146)

• السلاسل الجانبية: Ala $\ce{-CH3}$، Ser $\ce{-CH2-OH}$، Lys $\ce{-(CH2)4-NH2}$.
• الصيغة:

$ \begin{array}{l} \ce{H2N-CH(CH3)-CO} \\ \ce{-NH-CH(CH2-OH)-CO} \\ \ce{-NH-CH((CH2)4-NH2)-COOH} \end{array} $

• الاسم: **ألانيل سيريل ليزين** ($\text{alanyl-séryl-lysine}$).
• $M = 89 + 105 + 146 - 2\times18 = 304\ g\,mol^{-1}$، والصيغة المجملة $\ce{C12H24N4O5}$ ($144 + 24 + 56 + 80 = 304$).

لاحظ أن مجموعة $\ce{-NH2}$ الثانية في الليزين (الموضع ε) تبقى حرة: الرابطة الببتيدية تكوّنها مجموعة الأمين α وحدها.

مثال محلول 2: من الصيغة إلى التسلسل

تعرّف على الأحماض الأمينية المكوّنة للببتيد الآتي وسمّه:

$ \begin{array}{l} \ce{H2N-CH(CH2-C6H5)-CO} \\ \ce{-NH-CH2-CO} \\ \ce{-NH-CH(CH2-COOH)-COOH} \end{array} $

• نقطع كل رابطة $\ce{C-N}$ في المجموعات $\ce{-CO-NH\bond{-}}$، ونضيف $\ce{OH}$ إلى الكربونيل و $\ce{H}$ إلى الآزوت.
• البقية الأولى سلسلتها $\ce{-CH2-C6H5}$: الفينيل ألانين Phe. الثانية سلسلتها الجانبية ذرة $\ce{H}$ فقط ($\ce{-CH2\bond{-}}$ في الهيكل): الغليسين Gly. الثالثة سلسلتها $\ce{-CH2-COOH}$: حمض الأسبارتيك Asp.
• النتيجة: **$\text{Phe-Gly-Asp}$، فينيل ألانيل غليسيل حمض الأسبارتيك**، ثلاثي ببتيد فيه رابطتان ببتيديتان.

عدد التسلسلات الممكنة

كل ترتيب مختلف للأحماض الأمينية يعطي ببتيداً مختلفاً. نميّز ثلاث حالات:

| الحالة | العدد | مثال | |---|---|---| | $n$ أحماض أمينية مختلفة، كل منها مرة واحدة | $n!$ | 3 أحماض: $3! = 6$ | | تركيب فيه تكرار ($a$ مرات حمض و $b$ مرات آخر…) | $\dfrac{n!}{a!\,b!\cdots}$ | 2 Gly و 1 Ala: $\dfrac{3!}{2!} = 3$ | | اختيار حر من $k$ أحماض أمينية مع جواز التكرار | $k^n$ | ثنائيات من 20 حمضاً: $20^2 = 400$ |

إذا فُرض حمض أميني معيّن في الطرف N (أو في الطرف C) نرتّب الباقي فقط: $(n-1)!$ إذا كانت الأحماض كلها مختلفة.

مثال محلول 3: قائمة ثلاثيات الببتيد

اكتب كل ثلاثيات الببتيد التي يدخل فيها Gly و Ala و Val، كل منها مرة واحدة.

• العدد: $3! = 6$.
• نثبّت الطرف N في كل مرة ونبدّل الحمضين الباقيين:
• $\text{Gly-Ala-Val}$ و $\text{Gly-Val-Ala}$
• $\text{Ala-Gly-Val}$ و $\text{Ala-Val-Gly}$
• $\text{Val-Gly-Ala}$ و $\text{Val-Ala-Gly}$
• النتيجة: **ستة ثلاثيات ببتيد مختلفة** لها الصيغة المجملة نفسها والكتلة المولية نفسها $75 + 89 + 117 - 36 = 245\ g\,mol^{-1}$.

مثال محلول 4: تسلسلات بشروط

رباعي ببتيد يتكوّن من Gly و Ala و Ser و Lys، كل منها مرة واحدة. كم تسلسلاً ممكناً له؟ وكم منها يكون فيه Lys طرفاً N؟ وكم منها يكون فيه Lys طرفاً N و Ser طرفاً C؟

• دون شرط: $4! = 24$ تسلسلاً.
• Lys مثبّت في الطرف N: نرتّب الثلاثة الباقية، $3! = 6$.
• Lys في الطرف N و Ser في الطرف C: يبقى موضعان لـ Gly و Ala، $2! = 2$: $\text{Lys-Gly-Ala-Ser}$ و $\text{Lys-Ala-Gly-Ser}$.
• النتيجة: **24 ثم 6 ثم 2**.

> ملاحظة للامتحان: اقرأ نص السؤال جيداً: «كل حمض مرة واحدة» يعني $n!$، و«يمكن تكرار الحمض» يعني $k^n$. وإذا ذُكر التركيب بأعداد مكرّرة فاقسم على عاملي كل تكرار.

أخطاء شائعة

• كتابة الاسم بإبقاء «ين» في كل البقايا («غليسين ألانين سيرين») أو بإبدال اسم البقية الأخيرة أيضاً («غليسيل ألانيل سيريل»).
• قراءة الببتيد من اليمين إلى اليسار لأن النص عربي: الرموز تُقرأ دائماً من الطرف N على اليسار.
• ربط مجموعة الأمين ε لليزين أو الكربوكسيل الجانبي لحمض الأسبارتيك في الرابطة الببتيدية بدل المجموعتين α.
• استعمال $k^n$ بدل $n!$ عندما يُشترط ألا يتكرر أيّ حمض أميني.

3. التحليل المائي الحمضي

مبدأ التحليل المائي

> التحليل المائي (hydrolyse) لببتيد، أو إماهته، هو تفكيك روابطه الببتيدية بتدخّل الماء، فنسترجع الأحماض الأمينية المكوّنة له. إنه التفاعل العكسي لتفاعل التكاثف الذي كوّن الرابطة الببتيدية.

المعادلة العامة لإماهة ثنائي الببتيد:

$ \small\ce{H2N-CH(R1)-CO-NH-CH(R2)-COOH + H2O} $

$ \small\ce{-> H2N-CH(R1)-COOH + H2N-CH(R2)-COOH} $

تنكسر الرابطة $\ce{C-N}$: تأخذ ذرة الكربون مجموعة $\ce{OH}$ فتعود مجموعة كربوكسيل، وتأخذ ذرة الآزوت ذرة $\ce{H}$ فتعود مجموعة أمين. وفي الحالة العامة:

> إماهة جزيئة واحدة من ببتيد خطي من $n$ حمضاً أمينياً تستهلك $n - 1$ جزيئة ماء وتعطي $n$ حمضاً أمينياً.

الماء وحده يكسر الرابطة الببتيدية ببطء شديد في الشروط العادية، لذلك نحتاج إلى وسيط: حمض قوي مع التسخين (هذا الجزء)، أو إنزيمات (الجزء الموالي).

التحليل المائي الحمضي الكلي

الشروط التجريبية

| العامل | القيمة المعتادة | |---|---| | الكاشف | حمض كلور الماء $\ce{HCl}$ بتركيز $6\ mol\,L^{-1}$ | | درجة الحرارة | نحو 110 °C | | المدة | نحو 24 ساعة، في أنبوب مغلق | | النتيجة | انكسار كل الروابط الببتيدية |

خصائصه

• **كلي:** تنكسر كل الروابط الببتيدية، فلا يبقى إلا أحماض أمينية حرة.
• **غير نوعي:** الحمض يكسر أيّ رابطة ببتيدية مهما كان الحمضان الأمينيان على جانبيها.
• **يعطي التركيب لا التسلسل:** نعرف أيّ الأحماض الأمينية في الببتيد وبأيّ نسب مولية، لكننا نفقد ترتيبها. لذلك نسمّيه تحليلاً للتركيب (composition).
• في الوسط الحمضي القوي تكون كل الأحماض الأمينية الناتجة على شكل **كاتيونات** $\ce{H3N^+-CH(R)-COOH}$. بعد التخلص من الحمض الزائد نتعرّف على الأحماض الأمينية بالكروماتوغرافيا الورقية أو بالهجرة الكهربائية.

للاطلاع: في الواقع يُتلف هذا التحليل التريبتوفان، ويحوّل الأسباراجين والغلوتامين إلى حمض الأسبارتيك وحمض الغلوتاميك. في تمارين البكالوريا نعتبره تحليلاً كلياً مثالياً يعطي كل الأحماض الأمينية سليمة.

التحليل المائي الحمضي الجزئي

إذا استعملنا حمضاً أقل تركيزاً أو مدة أقصر انكسرت بعض الروابط فقط، وانكسارها عشوائي، فنحصل على مزيج من قطع (fragments) قصيرة: ثنائيات وثلاثيات ببتيد وأحماض أمينية حرة. للقطع الجزئية فائدة كبيرة: كل قطعة تحفظ جزءاً من الترتيب، والقطع المتداخلة (chevauchement) تسمح بإعادة بناء التسلسل كاملاً.

مثال محلول 1: إعادة بناء التسلسل بالتداخل

خماسي ببتيد يعطي تحليله الكلي Ala و Gly و Leu و Phe و Ser، وطرفه N هو السيرين. أعطى تحليله الجزئي القطع: $\text{Gly-Leu-Phe}$ و $\text{Ser-Gly}$ و $\text{Phe-Ala}$. جد تسلسله.

• الطرف N هو Ser، والقطعة $\text{Ser-Gly}$ تبيّن أن Gly يليه.
• القطعة $\text{Gly-Leu-Phe}$ تبدأ بـ Gly، فنضيف بعده Leu ثم Phe.
• القطعة $\text{Phe-Ala}$ تبيّن أن Ala يلي Phe، وهو الحمض الخامس الباقي، فهو الطرف C.

$ \begin{array}{ccccccccc} \text{Ser} & - & \text{Gly} & & & & & & \\ & & \text{Gly} & - & \text{Leu} & - & \text{Phe} & & \\ & & & & & & \text{Phe} & - & \text{Ala} \\ \hline \text{Ser} & - & \text{Gly} & - & \text{Leu} & - & \text{Phe} & - & \text{Ala} \end{array} $

• النتيجة: **$\text{Ser-Gly-Leu-Phe-Ala}$**، أي سيريل غليسيل ليوسيل فينيل ألانيل ألانين.

الحسابات الكمية

عند الإماهة الكلية لـ $n_P$ مول من ببتيد خطي من $n$ بقية:

• كل حمض أميني يظهر $x$ مرات في السلسلة يعطي $x\,n_P$ مول.
• عدد مولات الماء المستهلك $(n-1)\,n_P$.
• **انحفاظ الكتلة:** $m(\text{peptide}) + m(\ce{H2O}) = \sum m(\text{aa})$.

مثال محلول 2: كتل النواتج

نحلّل كلياً $2{,}33\ g$ من ثلاثي الببتيد $\text{Ala-Gly-Ser}$ ($M = 233\ g\,mol^{-1}$). احسب كتلة كل حمض أميني ناتج وكتلة الماء المستهلك. ($M$ بـ g/mol: Ala = 89، Gly = 75، Ser = 105، $\ce{H2O}$ = 18)

• $n_P = \dfrac{2{,}33}{233} = 0{,}0100\ mol$.
• كل حمض أميني مرة واحدة: $0{,}0100\ mol$ من كل منها، أي $m(\text{Ala}) = 0{,}890\ g$ و $m(\text{Gly}) = 0{,}750\ g$ و $m(\text{Ser}) = 1{,}05\ g$.
• الماء: رابطتان في كل جزيئة، $n(\ce{H2O}) = 2\times0{,}0100 = 0{,}0200\ mol$، أي $0{,}360\ g$.
• التحقق بانحفاظ الكتلة: $2{,}33 + 0{,}36 = 2{,}69\ g$، و $0{,}89 + 0{,}75 + 1{,}05 = 2{,}69\ g$.
• النتيجة: **$0{,}890\ g$ من Ala و $0{,}750\ g$ من Gly و $1{,}05\ g$ من Ser، مع استهلاك $0{,}360\ g$ من الماء**.

مثال محلول 3: من كتل النواتج إلى التركيب

الإماهة الكلية لـ $2{,}79\ g$ من ببتيد خطي (P) تعطي $1{,}50\ g$ من الغليسين و $1{,}65\ g$ من الفينيل ألانين فقط. جد تركيب (P) وكتلته المولية وتسلسلاته الممكنة. ($M$ بـ g/mol: Gly = 75، Phe = 165، $\ce{H2O}$ = 18)

• $n(\text{Gly}) = \dfrac{1{,}50}{75} = 0{,}0200\ mol$ و $n(\text{Phe}) = \dfrac{1{,}65}{165} = 0{,}0100\ mol$: النسبة $2 : 1$.
• أبسط تركيب يوافق هذه النسبة: جزيئتا Gly وجزيئة Phe، أي ثلاثي ببتيد كتلته $M = 2\times75 + 165 - 2\times18 = 279\ g\,mol^{-1}$، ومنه $n_P = \dfrac{2{,}79}{279} = 0{,}0100\ mol$، فكل جزيئة تعطي فعلاً 2 Gly و 1 Phe.
• التحقق بالماء: $1{,}50 + 1{,}65 - 2{,}79 = 0{,}36\ g$، أي $0{,}0200\ mol$، وهو $2\times n_P$: رابطتان في كل جزيئة، كما ينتظر من ثلاثي ببتيد.
• التسلسلات الممكنة: $\dfrac{3!}{2!} = 3$، وهي $\text{Gly-Gly-Phe}$ و $\text{Gly-Phe-Gly}$ و $\text{Phe-Gly-Gly}$.
• النتيجة: **(P) ثلاثي ببتيد تركيبه 2 Gly و 1 Phe، $M = 279\ g\,mol^{-1}$، وله 3 تسلسلات ممكنة** لا يفصل بينها التحليل الحمضي الكلي.

> ملاحظة للامتحان: النسبة المولية للأحماض الأمينية الناتجة تعطي التركيب، وعدد مولات الماء المستهلك لكل مول من الببتيد يعطي عدد الروابط الببتيدية. استعمل انحفاظ الكتلة للتحقق من نتيجتك.

أخطاء شائعة

• الاعتقاد بأن التحليل الحمضي الكلي يعطي ترتيب الأحماض الأمينية.
• نسيان كتلة الماء في انحفاظ الكتلة: كتلة النواتج **أكبر** من كتلة الببتيد.
• حساب الماء المستهلك بـ $n$ جزيئة بدل $n - 1$ لببتيد خطي.
• قراءة قطع التحليل الجزئي معكوسة: كل قطعة مكتوبة هي أيضاً من الطرف N إلى الطرف C.

4. التحليل الإنزيمي بالتربسين والكيموتربسين

الإماهة بالإنزيمات

الإنزيمات (enzymes) وسائط حيوية من طبيعة بروتينية، تعمل في شروط معتدلة: درجة حرارة قريبة من 37 °C ووسط قريب من التعادل أو قاعدي قليلاً. من الإنزيمات التي تحلّل الببتيدات إنزيمان هضميان يفرزهما البنكرياس في صورة غير نشطة، ويُنشَّطان ويعملان في الأمعاء الدقيقة: التربسين (trypsine) والكيموتربسين (chymotrypsine).

يختلف التحليل الإنزيمي عن التحليل الحمضي في نقطتين أساسيتين:

• **نوعي** (spécifique): لا يكسر الإنزيم إلا الروابط المجاورة لأحماض أمينية معيّنة.
• **جزئي**: تبقى الروابط الأخرى سليمة، فنحصل على **قطع ببتيدية** تحفظ جزءاً من التسلسل.

قاعدة التربسين

> التربسين يكسر الرابطة الببتيدية الواقعة على جهة الكربوكسيل لليزين Lys والأرجينين Arg، أي الرابطة التي يقدّم فيها Lys أو Arg مجموعة الكربونيل $\ce{C=O}$.

نرمز لموضع القطع بسهم فوق الرابطة:

$ \text{Gly-Lys}\overset{\downarrow}{-}\text{Ala-Arg}\overset{\downarrow}{-}\text{Val} $

فنحصل على $\text{Gly-Lys}$ و $\text{Ala-Arg}$ و $\text{Val}$. لاحظ أن Lys و Arg يبقيان في آخر القطعة (طرفها C)، لا في أولها.

قاعدة الكيموتربسين

> الكيموتربسين يكسر الرابطة الببتيدية الواقعة على جهة الكربوكسيل للأحماض الأمينية العطرية Phe و Tyr و Trp.

$ \text{Ser-Phe}\overset{\downarrow}{-}\text{Gly-Tyr}\overset{\downarrow}{-}\text{Leu} $

فنحصل على $\text{Ser-Phe}$ و $\text{Gly-Tyr}$ و $\text{Leu}$.

للحفظ: التربسين ← الأحماض الأمينية القاعدية ذات السلسلة الطويلة (Lys و Arg)؛ الكيموتربسين ← الأحماض الأمينية العطرية (Phe و Tyr و Trp).

قواعد عدّ القطع

• ابحث في التسلسل عن الأحماض الأمينية المستهدفة.
• إذا كان الحمض المستهدف هو **الطرف C** فلا توجد رابطة على جهة كربوكسيله، فلا قطع.
• إذا كان عدد مواضع القطع $k$ فعدد القطع الناتجة $k + 1$.
• كل قطعة تنتهي بحمض مستهدف، **ما عدا** القطعة التي تحمل الطرف C للببتيد الأصلي.

مقارنة طرق التحليل المائي

| المقارنة | الحمضي الكلي | التربسين | الكيموتربسين | |---|---|---|---| | الشروط | $\ce{HCl}$ مركز، 110 °C، 24 ساعة | معتدلة، نحو 37 °C | معتدلة، نحو 37 °C | | الروابط المكسورة | كلها | على جهة كربوكسيل Lys و Arg | على جهة كربوكسيل Phe و Tyr و Trp | | النوع | كلي غير نوعي | جزئي نوعي | جزئي نوعي | | ما نستفيده | التركيب | قطعاً تنتهي بـ Lys أو Arg | قطعاً تنتهي بحمض عطري |

مثال محلول 1: تأثير الإنزيمين على ثماني ببتيد

نعطي ثماني الببتيد $\text{Gly-Phe-Ser-Lys-Ala-Tyr-Arg-Val}$.

أ) تأثير التربسين: المستهدف Lys (الموضع 4) و Arg (الموضع 7)، وكلاهما ليس الطرف C:

$ \small\text{Gly-Phe-Ser-Lys}\overset{\downarrow}{-}\text{Ala-Tyr-Arg}\overset{\downarrow}{-}\text{Val} $

النواتج: $\text{Gly-Phe-Ser-Lys}$ و $\text{Ala-Tyr-Arg}$ و $\text{Val}$ (ثلاث قطع).

ب) تأثير الكيموتربسين: المستهدف Phe (الموضع 2) و Tyr (الموضع 6):

$ \small\text{Gly-Phe}\overset{\downarrow}{-}\text{Ser-Lys-Ala-Tyr}\overset{\downarrow}{-}\text{Arg-Val} $

النواتج: $\text{Gly-Phe}$ و $\text{Ser-Lys-Ala-Tyr}$ و $\text{Arg-Val}$.

ج) تأثير الإنزيمين معاً: تنكسر الروابط الأربع، فنحصل على $\text{Gly-Phe}$ و $\text{Ser-Lys}$ و $\text{Ala-Tyr}$ و $\text{Arg}$ و $\text{Val}$.

د) اختبار بيوري على نواتج التربسين: رباعي الببتيد وثلاثي الببتيد يعطيان لوناً بنفسجياً (رابطتان فأكثر)، والفالين الحر لا يعطيه.

مثال محلول 2: من القطع إلى التسلسل

سداسي ببتيد تركيبه Ala و Arg و Gly و Lys و Phe و Val. نعالجه بالتربسين فنحصل على $\text{Gly-Phe-Lys}$ و $\text{Ala-Arg}$ و $\text{Val}$، ونعالج عينة أخرى بالكيموتربسين فنحصل على $\text{Gly-Phe}$ و $\text{Lys-Ala-Arg-Val}$. جد التسلسل.

• قطع التربسين: $\text{Val}$ لا ينتهي بـ Lys ولا بـ Arg، فهو القطعة الحاملة للطرف C: **Val هو الطرف C**.
• قطع الكيموتربسين: $\text{Gly-Phe}$ ينتهي بحمض عطري فهو قطعة داخلية، و $\text{Lys-Ala-Arg-Val}$ ينتهي بـ Val فهو قطعة الطرف C. إذن $\text{Gly-Phe}$ يأتي أولاً.
• التسلسل: $\text{Gly-Phe}$ ثم $\text{Lys-Ala-Arg-Val}$، أي $\text{Gly-Phe-Lys-Ala-Arg-Val}$.
• التحقق بالتربسين: القطع بعد Lys (الموضع 3) وبعد Arg (الموضع 5) يعطي $\text{Gly-Phe-Lys}$ و $\text{Ala-Arg}$ و $\text{Val}$، وهي النتيجة التجريبية.
• النتيجة: **$\text{Gly-Phe-Lys-Ala-Arg-Val}$**. لو وضعنا القطعتين بالترتيب الآخر ($\text{Lys-Ala-Arg-Val-Gly-Phe}$) لأعطى التربسين Lys حراً و $\text{Ala-Arg}$ و $\text{Val-Gly-Phe}$، وهذا لا يوافق التجربة.

> ملاحظة للامتحان: ابدأ دائماً بتحديد القطعة التي لا تنتهي بالحمض المستهدف: إنها تحمل الطرف C. ثم استعمل نتائج الإنزيم الثاني لترتيب القطع الأخرى، وتحقق في الأخير بتطبيق الإنزيمين على التسلسل الذي وجدته.

أخطاء شائعة

• القطع على جهة الأمين (قبل Lys) بدل جهة الكربوكسيل (بعد Lys)، فيظهر Lys في أول القطعة بدل آخرها.
• الخلط بين الإنزيمين: التربسين للقاعديين Lys و Arg، والكيموتربسين للعطرية.
• نسيان Arg مع التربسين، أو Trp مع الكيموتربسين.
• قطع رابطة بعد حمض مستهدف يقع في الطرف C، ولا رابطة بعده.
• وصف التحليل الإنزيمي بأنه كلي: هو جزئي ونوعي.

5. الصيغ الأيونية للببتيد

المجموعات القابلة للتأين في الببتيد

الببتيد، مثل الحمض الأميني، أمفوتيري: يحمل مجموعات حمضية ومجموعات قاعدية، وتتغير شحنته بتغير $\text{pH}$ الوسط. لكن عدد المجموعات القابلة للتأين فيه أقل مما في مجموع أحماضه الأمينية، لأن المجموعات α الداخلة في الروابط الببتيدية لم تعد حمضية ولا قاعدية.

المجموعات التي نأخذها بعين الاعتبار هي فقط:

• مجموعة **الأمين α للطرف N**.
• مجموعة **الكربوكسيل α للطرف C**.
• **السلاسل الجانبية القابلة للتأين**: $\ce{-COOH}$ في Asp و Glu، و $\ce{-NH2}$ في Lys، ومجموعة الغوانيدين في Arg، وحلقة الإيميدازول في His، و $\ce{-SH}$ في Cys، و $\ce{-OH}$ الفينولية في Tyr.

الروابط الببتيدية $\ce{-CO-NH\bond{-}}$ لا تتأين، وسلاسل الأحماض الأمينية المتعادلة الأخرى (مثل $\ce{-CH3}$ أو $\ce{-CH2-OH}$ الكحولية في Ser) لا نغيّرها.

الصيغ في الوسطين الحمضي القوي والقاعدي القوي

| المجموعة | عند $\text{pH} = 1$ | الشحنة | عند $\text{pH} = 13$ | الشحنة | |---|---|---|---|---| | أمين α للطرف N | $\ce{-NH3^+}$ | +1 | $\ce{-NH2}$ | 0 | | كربوكسيل α للطرف C | $\ce{-COOH}$ | 0 | $\ce{-COO^-}$ | −1 | | كربوكسيل جانبي (Asp، Glu) | $\ce{-COOH}$ | 0 | $\ce{-COO^-}$ | −1 | | أمين جانبي (Lys) | $\ce{-NH3^+}$ | +1 | $\ce{-NH2}$ | 0 | | غوانيدين (Arg)، إيميدازول (His) | مبرتن | +1 | متعادل | 0 | | $\ce{-SH}$ (Cys) | $\ce{-SH}$ | 0 | $\ce{-S^-}$ | −1 | | $\ce{-OH}$ فينولي (Tyr) | $\ce{-OH}$ | 0 | $\ce{-O^-}$ | −1 |

> في وسط حمضي قوي ($\text{pH} = 1$، أصغر من كل قيم $\text{pK}_a$): كل المجموعات مبرتنة. الببتيد كاتيون، وشحنته تساوي عدد المجموعات القاعدية: الطرف N زائد عدد بقايا Lys و Arg و His. > > في وسط قاعدي قوي ($\text{pH} = 13$، أكبر من كل قيم $\text{pK}_a$ المعطاة، وأكبرها 12,48 للأرجينين): كل المجموعات فقدت بروتونها القابل للتأين. الببتيد أنيون، وشحنته تساوي سالب عدد المجموعات الحمضية: الطرف C زائد عدد بقايا Asp و Glu و Cys و Tyr.

قيم $\text{pK}_a$ لطرفي الببتيد تختلف قليلاً عن قيمها في الأحماض الأمينية الحرة، لكن هذا لا يغيّر الصيغ عند $\text{pH} = 1$ و $\text{pH} = 13$، لذلك يطلبها موضوع البكالوريا غالباً في هذين الوسطين.

مثال محلول 1: ببتيد فيه سلسلتان قابلتان للتأين

اكتب الصيغة الأيونية الغالبة لثلاثي الببتيد $\text{Gly-Lys-Asp}$ عند $\text{pH} = 1$ ثم عند $\text{pH} = 13$، وأعط شحنته في كل حالة.

عند $\text{pH} = 1$: نبرتن الأمينين ونترك الكربوكسيلين على الشكل $\ce{-COOH}$:

$ \begin{array}{l} \ce{H3N^+-CH2-CO} \\ \ce{-NH-CH((CH2)4-NH3^+)-CO} \\ \ce{-NH-CH(CH2-COOH)-COOH} \end{array} $

الشحنة: $(+1) + (+1) = $ +2 (الطرف N وأمين الليزين).

عند $\text{pH} = 13$: ننزع بروتون الكربوكسيلين ونعيد الأمينين إلى $\ce{-NH2}$:

$ \begin{array}{l} \ce{H2N-CH2-CO} \\ \ce{-NH-CH((CH2)4-NH2)-CO} \\ \ce{-NH-CH(CH2-COO^-)-COO^-} \end{array} $

الشحنة: $(-1) + (-1) = $ −2 (الطرف C والكربوكسيل الجانبي لحمض الأسبارتيك).

مثال محلول 2: التيروزين والسيستئين في وسط قاعدي

اكتب الصيغة الأيونية لثلاثي الببتيد $\text{Ala-Tyr-Cys}$ عند $\text{pH} = 13$. (Tyr: $\text{pK}_R = 10{,}07$؛ Cys: $\text{pK}_R = 8{,}18$)

• $13 > 10{,}07$ و $13 > 8{,}18$: الفينول والثيول فقدا بروتونيهما.
• الصيغة:

$ \begin{array}{l} \ce{H2N-CH(CH3)-CO} \\ \ce{-NH-CH(CH2-C6H4-O^-)-CO} \\ \ce{-NH-CH(CH2-S^-)-COO^-} \end{array} $

• الشحنة: **−3**. أما عند $\text{pH} = 1$ فشحنته **+1** فقط، لأن الطرف N هو المجموعة القاعدية الوحيدة.

الشحنة عند pH متوسط والهجرة الكهربائية

بين $\text{pH} \approx 5$ و $\text{pH} \approx 7$ يمكن تقدير الشحنة بقاعدة بسيطة، بشرط ألا يحتوي الببتيد على His (قيمة $\text{pK}_R$ له 6,00 تقع في هذا المجال):

• الكربوكسيلات كلها (الطرف C و Asp و Glu) على الشكل $\ce{-COO^-}$: لكل منها −1.
• الأمين α للطرف N وأمين Lys وغوانيدين Arg مبرتنة: لكل منها +1.
• $\ce{-SH}$ و $\ce{-OH}$ الفينولية متعادلتان.

ثم نطبّق قواعد الهجرة الكهربائية (électrophorèse): الببتيد الموجب يهاجر نحو المهبط (القطب السالب)، والسالب نحو المصعد (القطب الموجب)، والمعدوم الشحنة يبقى قرب خط الإيداع؛ ويكون ذلك عندما يساوي $\text{pH}$ الوسط نقطة التعادل الكهربائي $\text{pH}_i$ للببتيد.

مثال محلول 3: فصل ثلاثة ببتيدات عند pH = 6

نضع على ورقة الهجرة الكهربائية عند $\text{pH} = 6$ مزيجاً من $\text{Lys-Gly-Lys}$ و $\text{Asp-Gly-Glu}$ و $\text{Gly-Ala-Ser}$. حدّد اتجاه هجرة كل منها.

| الببتيد | المجموعات الموجبة | المجموعات السالبة | الشحنة | الهجرة | |---|---|---|---|---| | $\text{Lys-Gly-Lys}$ | الطرف N و 2 Lys: +3 | الطرف C: −1 | +2 | نحو المهبط | | $\text{Asp-Gly-Glu}$ | الطرف N: +1 | الطرف C و Asp و Glu: −3 | −2 | نحو المصعد | | $\text{Gly-Ala-Ser}$ | الطرف N: +1 | الطرف C: −1 | 0 تقريباً | يبقى قرب خط الإيداع |

النتيجة: تنفصل الببتيدات الثلاثة: الأول نحو القطب السالب، والثاني نحو القطب الموجب، والثالث يكاد لا يتحرك.

مثال محلول 4: نقطة التعادل الكهربائي لثنائي ببتيد متعادل

نعطي لثنائي الببتيد $\text{Gly-Gly}$: $\text{pK}_a(\ce{-COOH}) = 3{,}14$ و $\text{pK}_a(\ce{-NH3^+}) = 8{,}25$. احسب $\text{pH}_i$ واكتب صيغه الثلاث.

• لا سلسلة جانبية قابلة للتأين، فـ $\text{pH}_i$ هو متوسط القيمتين: $\text{pH}_i = \dfrac{3{,}14 + 8{,}25}{2} = 5{,}695$، أي **$\text{pH}_i \approx 5{,}70$**.
• الصيغ:
• عند $\text{pH} = 1$: $\ce{H3N^+-CH2-CO-NH-CH2-COOH}$ (كاتيون، +1).
• عند $\text{pH} = \text{pH}_i$: $\ce{H3N^+-CH2-CO-NH-CH2-COO^-}$ (أيون مزدوج، شحنة إجمالية معدومة).
• عند $\text{pH} = 13$: $\ce{H2N-CH2-CO-NH-CH2-COO^-}$ (أنيون، −1).
• لاحظ أن قيمتي $\text{pK}_a$ هنا تختلفان عن قيمتي الغليسين الحر (2,34 و 9,60): التأين يتأثر بجوار الرابطة الببتيدية.

> ملاحظة للامتحان: قبل كتابة الصيغة عدّ المجموعات القابلة للتأين وضع لكل منها شحنتها في جدول صغير، ثم اكتب الصيغة سطراً لكل بقية، وتحقق أن مجموع الشحن في الصيغة يساوي ما حسبته.

أخطاء شائعة

• برتنة آزوت الرابطة الببتيدية أو نزع بروتونه: الرابطة $\ce{-CO-NH\bond{-}}$ لا تتأين.
• ترك أمين الليزين الجانبي $\ce{-NH2}$ عند $\text{pH} = 1$، أو نسيان الكربوكسيل الجانبي لـ Asp و Glu عند $\text{pH} = 13$.
• نسيان تأين $\ce{-OH}$ التيروزين و $\ce{-SH}$ السيستئين عند $\text{pH} = 13$.
• كتابة $\ce{-COO^-}$ للطرف C عند $\text{pH} = 1$: في الوسط الحمضي القوي يكون $\ce{-COOH}$.
• الخلط بين اتجاهي الهجرة: الشحنة الموجبة تتجه نحو القطب السالب (المهبط).

6. تمارين محلولة بنمط البكالوريا

التمرين الأول: التعرّف على ثلاثي ببتيد وصيغه

ثلاثي ببتيد (P) صيغته الرمزية $\text{X-Y-Z}$، حيث X و Y و Z أحماض أمينية من الجدول الآتي:

| الحمض الأميني | Gly | Ser | Asp | Tyr | Lys | |---|---|---|---|---|---| | $\text{pH}_i$ | 5,97 | 5,68 | 2,77 | 5,66 | 9,74 |

• X يهاجر نحو المهبط (القطب السالب) في هجرة كهربائية عند $\text{pH} = 7$.
• Y غير فعال ضوئياً.
• Z يعطي اختبار الكزانثوبروتييك موجباً.

المعطيات: $M$ بـ g/mol: Gly = 75، Tyr = 181، Lys = 146، $\ce{H2O}$ = 18. للتيروزين $\text{pK}_R = 10{,}07$، ومجموعة $\ce{-OH}$ فيه في الموضع para.

• تعرّف على X و Y و Z مع التعليل، ثم اكتب (P) بالرموز وسمّه.
• اكتب الصيغة نصف المفصلة لـ (P) وحدّد عدد روابطه الببتيدية.
• ما نتيجة اختبار بيوري على (P)؟ علّل.
• اكتب الصيغة الأيونية الغالبة لـ (P) عند $\text{pH} = 1$ وعند $\text{pH} = 13$، وأعط الشحنة في كل حالة.
• ما نواتج تأثير التربسين على (P)؟ وما نواتج تأثير الكيموتربسين؟
• احسب الكتلة المولية لـ (P)، ثم كتل الأحماض الأمينية الناتجة عن الإماهة الكلية لـ $1{,}83\ g$ منه.

الحل

1. الهجرة نحو القطب السالب تعني شحنة موجبة عند $\text{pH} = 7$، أي $\text{pH}_i > 7$: الحمض الوحيد هو الليزين، فـ X = Lys. الحمض الأميني الوحيد غير الفعال ضوئياً هو الغليسين (كربونه α يحمل ذرتي هيدروجين)، فـ Y = Gly. اختبار الكزانثوبروتييك يكشف الحلقة العطرية، والحمض العطري الوحيد في الجدول هو التيروزين، فـ Z = Tyr.

(P) هو $\text{Lys-Gly-Tyr}$: ليزيل غليسيل تيروزين.

2. الصيغة نصف المفصلة:

$ \begin{array}{l} \ce{H2N-CH((CH2)4-NH2)-CO} \\ \ce{-NH-CH2-CO} \\ \ce{-NH-CH(CH2-C6H4-OH)-COOH} \end{array} $

فيه رابطتان ببتيديتان $\ce{-CO-NH\bond{-}}$: بين Lys و Gly، وبين Gly و Tyr.

3. يحتوي (P) على رابطتين ببتيديتين، فاختبار بيوري ($\ce{CuSO4}$ في وسط قاعدي) موجب: يظهر لون بنفسجي.

4. عند $\text{pH} = 1$: الأمينان مبرتنان، والكربوكسيل والفينول متعادلان:

$ \begin{array}{l} \ce{H3N^+-CH((CH2)4-NH3^+)-CO} \\ \ce{-NH-CH2-CO} \\ \ce{-NH-CH(CH2-C6H4-OH)-COOH} \end{array} $

الشحنة +2.

عند $\text{pH} = 13$: الأمينان على الشكل $\ce{-NH2}$، والكربوكسيل $\ce{-COO^-}$، والفينول $\ce{-O^-}$ لأن $13 > 10{,}07$:

$ \begin{array}{l} \ce{H2N-CH((CH2)4-NH2)-CO} \\ \ce{-NH-CH2-CO} \\ \ce{-NH-CH(CH2-C6H4-O^-)-COO^-} \end{array} $

الشحنة −2.

5. التربسين يقطع على جهة كربوكسيل Lys، أي الرابطة $\text{Lys}\overset{\downarrow}{-}\text{Gly}$، فيعطي الليزين حراً وثنائي الببتيد $\text{Gly-Tyr}$. الكيموتربسين يستهدف Tyr، لكنه الطرف C ولا رابطة بعده، فـ (P) لا يتأثر بالكيموتربسين.

6. $M(P) = 146 + 75 + 181 - 2\times18 = 366\ g\,mol^{-1}$ (الصيغة المجملة $\ce{C17H26N4O5}$).

$n(P) = \dfrac{1{,}83}{366} = 0{,}00500\ mol$، وتعطي الإماهة $0{,}00500\ mol$ من كل حمض أميني:

• $m(\text{Lys}) = 0{,}00500\times146 = 0{,}730\ g$
• $m(\text{Gly}) = 0{,}00500\times75 = 0{,}375\ g$
• $m(\text{Tyr}) = 0{,}00500\times181 = 0{,}905\ g$

التحقق: الماء المستهلك $2\times0{,}00500\times18 = 0{,}180\ g$، و $1{,}83 + 0{,}18 = 2{,}01\ g = 0{,}730 + 0{,}375 + 0{,}905$.

التمرين الثاني: تعيين تسلسل خماسي ببتيد

الإماهة الحمضية الكلية لخماسي ببتيد (Q) تعطي خمسة أحماض أمينية مختلفة: Ala و Arg و Gly و Tyr و Val.

• كم تسلسلاً ممكناً لـ (Q) بمعرفة تركيبه فقط؟
• تبيّن أن الحمض الأميني ذا مجموعة الأمين α الحرة هو الفالين. كم تسلسلاً يبقى ممكناً؟
• يعطي التربسين رباعي ببتيد والألانين حراً. ماذا تستنتج؟
• يعطي الكيموتربسين ثنائي ببتيد وثلاثي ببتيد، وثنائي الببتيد وحده يعطي اختبار الكزانثوبروتييك موجباً. استنتج تسلسل (Q) وسمّه.
• ما نتيجة اختبار بيوري على كل من قطعتي الكيموتربسين؟
• احسب شحنة (Q) عند $\text{pH} = 1$ وعند $\text{pH} = 13$.
• نُجري هجرة كهربائية لنواتج التربسين عند $\text{pH} = 6{,}02$ (نقطة التعادل الكهربائي للألانين). حدّد سلوك كل منهما.

الحل

1. خمسة أحماض مختلفة، كل منها مرة واحدة: $5! = 120$ تسلسلاً.

2. الفالين مثبّت في الطرف N، فنرتّب الأربعة الباقية: $4! = 24$ تسلسلاً.

3. التربسين لا يستهدف في (Q) إلا Arg (لا يوجد Lys). نتجت قطعتان فقط، فهناك موضع قطع واحد، و Ala الحر هو ما بعد Arg: Arg في الموضع 4 و Ala في الموضع 5 (الطرف C)، والقطعة الأخرى رباعي ببتيد ينتهي بـ Arg.

4. الكيموتربسين يستهدف Tyr. قطعتان: ثنائي ببتيد وثلاثي ببتيد، فـ Tyr في الموضع 2 أو 3. ثنائي الببتيد هو الذي يحتوي على Tyr (كزانثوبروتييك موجب)، فهو القطعة الأولى $\text{Val-Tyr}$، و Tyr في الموضع 2. يبقى Gly في الموضع 3، وثلاثي الببتيد هو $\text{Gly-Arg-Ala}$.

(Q) = $\text{Val-Tyr-Gly-Arg-Ala}$: فاليل تيروزيل غليسيل أرجينيل ألانين.

التحقق: التربسين يقطع بعد Arg فيعطي $\text{Val-Tyr-Gly-Arg}$ و Ala، والكيموتربسين يقطع بعد Tyr فيعطي $\text{Val-Tyr}$ و $\text{Gly-Arg-Ala}$. ولو كان Tyr في الموضع 3 لأعطى الكيموتربسين ثلاثي الببتيد العطري وثنائي الببتيد $\text{Arg-Ala}$، وهذا يخالف المعطيات.

5. $\text{Val-Tyr}$ فيه رابطة ببتيدية واحدة: بيوري سالب. $\text{Gly-Arg-Ala}$ فيه رابطتان: بيوري موجب (بنفسجي).

6. عند $\text{pH} = 1$: المجموعات الموجبة هي أمين الطرف N وغوانيدين Arg، والكربوكسيل والفينول متعادلان: الشحنة +2. عند $\text{pH} = 13$: الأمين والغوانيدين متعادلان ($13 > 12{,}48$)، والكربوكسيل $\ce{-COO^-}$ وفينول Tyr $\ce{-O^-}$: الشحنة −2.

7. رباعي الببتيد $\text{Val-Tyr-Gly-Arg}$ عند $\text{pH} = 6{,}02$: الطرف N (+1) و Arg (+1) والطرف C (−1)، وفينول Tyr متعادل: الشحنة +1، فيهاجر نحو المهبط (القطب السالب). الألانين عند $\text{pH} = \text{pH}_i$ يكون أيوناً مزدوجاً شحنته الإجمالية معدومة: يبقى على خط الإيداع.

التمرين الثالث: دراسة كمية لرباعي ببتيد

رباعي ببتيد (T) كتلته المولية $290\ g\,mol^{-1}$. الإماهة الحمضية الكلية لـ $2{,}90\ g$ منه تعطي $1{,}50\ g$ من الغليسين و $0{,}890\ g$ من الألانين و $1{,}05\ g$ من السيرين.

المعطيات: $M$ بـ g/mol: Gly = 75، Ala = 89، Ser = 105، $\ce{H2O}$ = 18.

• احسب كمية مادة (T) وكمية مادة كل حمض أميني، واستنتج تركيب (T). تحقق من كتلته المولية.
• احسب كتلة الماء المستهلك وتحقق من انحفاظ الكتلة.
• كم تسلسلاً ممكناً لـ (T)؟
• الطرف N لـ (T) هو السيرين، والإماهة الجزئية لا تعطي من ثنائيات الببتيد إلا $\text{Ser-Gly}$ و $\text{Gly-Ala}$ و $\text{Ala-Gly}$. جد تسلسل (T) وسمّه.
• اكتب الصيغة نصف المفصلة لـ (T) عند $\text{pH} = 1$، وأعط شحنته عند $\text{pH} = 1$ وعند $\text{pH} = 13$.
• هل يتأثر (T) بالتربسين أو بالكيموتربسين؟ علّل.

الحل

1. $n(T) = \dfrac{2{,}90}{290} = 0{,}0100\ mol$.

• $n(\text{Gly}) = \dfrac{1{,}50}{75} = 0{,}0200\ mol$، أي 2 Gly في كل جزيئة.
• $n(\text{Ala}) = \dfrac{0{,}890}{89} = 0{,}0100\ mol$، أي 1 Ala.
• $n(\text{Ser}) = \dfrac{1{,}05}{105} = 0{,}0100\ mol$، أي 1 Ser.

التركيب: 2 Gly و 1 Ala و 1 Ser، أي أربع بقايا كما يقتضي رباعي الببتيد. التحقق: $M = 2\times75 + 89 + 105 - 3\times18 = 344 - 54 = 290\ g\,mol^{-1}$.

2. ثلاث روابط في كل جزيئة: $n(\ce{H2O}) = 3\times0{,}0100 = 0{,}0300\ mol$، أي $0{,}540\ g$. انحفاظ الكتلة: $2{,}90 + 0{,}54 = 3{,}44\ g$، و $1{,}50 + 0{,}89 + 1{,}05 = 3{,}44\ g$.

3. أربع بقايا منها اثنتان متماثلتان: $\dfrac{4!}{2!} = 12$ تسلسلاً.

4. Ser في الموضع 1، و $\text{Ser-Gly}$ يعطي Gly في الموضع 2. بعد Gly يأتي إما Ala ($\text{Gly-Ala}$ موجود) وإما Gly ($\text{Gly-Gly}$ غير موجود)، فـ Ala في الموضع 3. يبقى Gly في الموضع 4، و $\text{Ala-Gly}$ يؤكد ذلك.

(T) = $\text{Ser-Gly-Ala-Gly}$: سيريل غليسيل ألانيل غليسين.

5. عند $\text{pH} = 1$:

$ \begin{array}{l} \ce{H3N^+-CH(CH2-OH)-CO} \\ \ce{-NH-CH2-CO} \\ \ce{-NH-CH(CH3)-CO} \\ \ce{-NH-CH2-COOH} \end{array} $

الشحنة +1 عند $\text{pH} = 1$. وعند $\text{pH} = 13$ يصبح الطرف N $\ce{-NH2}$ والطرف C $\ce{-COO^-}$، و $\ce{-OH}$ السيرين كحولية لا تتأين: الشحنة −1.

6. لا يحتوي (T) على Lys ولا Arg ولا على حمض عطري، فـ لا يتأثر لا بالتربسين ولا بالكيموتربسين؛ ولا يتفكك إلا بالإماهة الحمضية.

> ملاحظة للامتحان: في تمارين التعرّف على ببتيد رتّب المعطيات حسب قوتها: الطرف المعروف، ثم قطعة الإنزيم التي تحمل الطرف C، ثم القطع المتداخلة. اكتب في الأخير تحققاً قصيراً بتطبيق كل المعطيات على التسلسل الذي وجدته.